Dal II secolo a.C. la piana sotto l'Aventino era il porto fluviale di Roma, l'Emporium: le merci, soprattutto grano, vino e marmi, arrivavano risalendo il Tevere e finivano nei magazzini come la Porticus Aemilia. Le anfore dell'olio, una volta svuotate, venivano rotte e accatastate: in oltre due secoli formarono il Monte Testaccio, il «monte dei cocci» alto circa 35 metri, da cui il rione prende il nome.
Per secoli la zona restò fuori dalla città abitata, tra orti, vigne e i prati del popolo romano, usati come pascolo. Nel Medioevo il monte ospitava i giochi di Carnevale e un palio, da cui il nome di Mons de Palio; nelle sue pendici furono scavate grotte usate come cantine e osterie, meta delle gite fuori porta dei romani.
Accanto alla Piramide di Caio Cestio, dal Settecento si seppellivano i non cattolici: è il Cimitero acattolico di Keats, Shelley e Gramsci. Ancora nell'Ottocento le chiatte risalivano il Tevere trainate dai bufali, sostituiti nel 1842 dai rimorchiatori a vapore, e nel 1869 Pio IX fece costruire la fontana che porta il suo nome.
Dopo il 1870 i piani di Roma capitale destinarono Testaccio all'industria e alle case operaie. Il Mattatoio di Gioacchino Ersoch fu costruito tra il 1888 e il 1891, ma le case crebbero lentamente: la svolta arrivò con la giunta del sindaco Ernesto Nathan, eletto nel 1907, quando l'Istituto Case Popolari costruì i grandi isolati con cortile, una decina dei quali su progetto di Giulio Magni.
Nel 1921 Testaccio fu separato dal rione Ripa e divenne rione, e dal 1929 al 1940 la Roma giocò qui, a Campo Testaccio. Dagli anni Sessanta cominciò la dismissione delle industrie lungo la via Ostiense; chiuso il Mattatoio nel 1975, i suoi padiglioni sono diventati università e spazi per l'arte, con il dipartimento di Architettura di Roma Tre e una sede del MACRO.
Dal 2012 il mercato ha una nuova sede coperta tra via Galvani e via Franklin. Oggi Testaccio conserva il suo carattere di rione popolare, con trattorie, locali e la vita intorno a piazza Testaccio; nel 2023 le sue strade hanno fatto da sfondo al film «C'è ancora domani» di Paola Cortellesi.
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